Resumen de la tesis que presenta Abigail Beatriz Quevedo Cesar como requisito parcial para la obtención
del grado de Maestra en Ciencias en Acuicultura
Cultivo in vitro de células germinales de lobina rayada (Morone saxatilis)
Resumen aprobado por:
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Dra. Carmen Guadalupe Paniagua Chávez
Codirectora de tesis
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Dra. Lucía Suárez López
Codirectora de tesis
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Resumen en español
Una estrategia para la conservación y producción de especies marinas es el cultivo in vitro de células germinales (espermatogonias y ovogonias), células precursoras de los gametos con capacidad de autorrenovación y proliferación. Este sistema busca recrear el microambiente gonadal mediante el control de variables ambientales y la adición de factores mitogénicos con el fin de promover viabilidad y proliferación de células germinales, para su uso en la reproducción subrogada, mejoramiento genético y evaluación de células criopreservadas tras la descongelación. En este estudio se evaluó el efecto de los factores mitogénicos suero de pez y extracto de embrión sobre la viabilidad, rendimiento y proliferación de células germinales de lobina rayada (Morone saxatilis), especie de importancia acuícola, a través de citometría de flujo. Las células se aislaron mediante disgregación enzimática de la gónada con tripsina al 0.3% y DNAsa al 0.05%, y se enriquecieron mediante doble purificación con gradiente discontinuo de Percoll y plaqueamiento diferencial, lo cual permitió el incrementar la pureza de células germinales. La calidad de las muestras fue adecuada, sin presencia de protozoarios. El sexo de los organismos se determinó por caracterización macroscópica y microscópica de la gónada. Las células germinales fueron identificadas con el marcador DDX4, con expresión positiva de 28% en ovogonias y 17.6% en espermatogonias, además de distinguirse por tamaño (FSC) y granularidad (SSC). Se compararon los efectos de tripsina (0.3%) y EDTA (0.25%) sobre la disociación celular durante cinco días de cultivo. No se observaron diferencias significativas en ovogonias, aunque la tripsina mostró mejores resultados en viabilidad y rendimiento; en espermatogonias, el EDTA fue más favorable. Finalmente, se evaluó el efecto del suero de pez al 1% y del extracto de embrión al 1% durante cinco y diez días. El tratamiento con suero de pez y extracto de embrión presentó los mejores efectos en ovogonias, mientras que en espermatogonias el extracto de embrión fue más efectivo. No obstante, aunque se registró proliferación aparente, no se observó incremento en la concentración celular de ovogonias, mientras que en espermatogonias sí se evidenció un aumento a los diez días de cultivo.
Una estrategia para la conservación y producción de especies marinas es el cultivo in vitro de células germinales (espermatogonias y ovogonias), células precursoras de los gametos con capacidad de autorrenovación y proliferación. Este sistema busca recrear el microambiente gonadal mediante el control de variables ambientales y la adición de factores mitogénicos con el fin de promover viabilidad y proliferación de células germinales, para su uso en la reproducción subrogada, mejoramiento genético y evaluación de células criopreservadas tras la descongelación. En este estudio se evaluó el efecto de los factores mitogénicos suero de pez y extracto de embrión sobre la viabilidad, rendimiento y proliferación de células germinales de lobina rayada (Morone saxatilis), especie de importancia acuícola, a través de citometría de flujo. Las células se aislaron mediante disgregación enzimática de la gónada con tripsina al 0.3% y DNAsa al 0.05%, y se enriquecieron mediante doble purificación con gradiente discontinuo de Percoll y plaqueamiento diferencial, lo cual permitió el incrementar la pureza de células germinales. La calidad de las muestras fue adecuada, sin presencia de protozoarios. El sexo de los organismos se determinó por caracterización macroscópica y microscópica de la gónada. Las células germinales fueron identificadas con el marcador DDX4, con expresión positiva de 28% en ovogonias y 17.6% en espermatogonias, además de distinguirse por tamaño (FSC) y granularidad (SSC). Se compararon los efectos de tripsina (0.3%) y EDTA (0.25%) sobre la disociación celular durante cinco días de cultivo. No se observaron diferencias significativas en ovogonias, aunque la tripsina mostró mejores resultados en viabilidad y rendimiento; en espermatogonias, el EDTA fue más favorable. Finalmente, se evaluó el efecto del suero de pez al 1% y del extracto de embrión al 1% durante cinco y diez días. El tratamiento con suero de pez y extracto de embrión presentó los mejores efectos en ovogonias, mientras que en espermatogonias el extracto de embrión fue más efectivo. No obstante, aunque se registró proliferación aparente, no se observó incremento en la concentración celular de ovogonias, mientras que en espermatogonias sí se evidenció un aumento a los diez días de cultivo.
Palabras clave: Morone saxatilis, células germinales, espermatogonias, ovogonias, cultivo in vitro
Resumen en inglés
A strategy for the conservation and production of marine species is the in vitro culture of germ cells (spermatogonia and oogonia), precursor cells of gametes with the capacity for self-renewal and proliferation. This system aims to recreate the gonadal microenvironment through the control of environmental variables and the addition of mitogenic factors, in order to promote the viability and proliferation of germ cells. It is applied in surrogate reproduction, genetic improvement programs, and in the evaluation of cryopreserved cells after thawing. In this study, the effect of fish serum and embryo extract as mitogenic factors was evaluated on the viability, cell yield, and proliferation of germ cells from striped bass (Morone saxatilis), a species of aquaculture importance, using flow cytometry. Germ cells were isolated from gonadal tissue by enzymatic dissociation with 0.3% trypsin and 0.05% DNase and enriched through double purification using a discontinuous Percoll gradient and differential plating, which increased germ cell purity. Sample quality was adequate, with no protozoa detected, and sex determination was achieved by macroscopic and microscopic gonadal characterization. Germ cells were identified with the DDX4 marker, showing positive expression of 28% in oogonia and 17.6% in spermatogonia, and were further distinguished by size (FSC) and granularity (SSC). The effects of 0.3% trypsin and 0.25% EDTA on cell dissociation were compared over five days of culture. No significant differences were observed in oogonia, although trypsin yielded better viability and performance; in spermatogonia, EDTA was more favorable. Finally, the effect of 1% fish serum and 1% embryo extract was evaluated over five and ten days. The combination of fish serum and embryo extract produced the best results in oogonia, while embryo extract alone was more effective in spermatogonia. However, although apparent proliferation was observed, no increase in oogonia cell concentration was detected, whereas spermatogonia showed a clear increase after ten days of culture.
Palabras clave: Morone saxatilis, germinal stem cells, spermatogonia, oogonia, in vitro culture